"Mechanizm regioselektywnego utleniającego odwodornienia 3-ketosteroidów przez dehydrogenazę Δ1-cholest-4-en-3-onu ze Sterolibacterium denitrificans"

Maciej_Szaleniec.jpg

Prof. Maciej Szaleniec

Kierownik projektu

Magdalena_Procner.jpg

Dr Magdalena Procner

Post-doc

michał_glanowski_edited.jpg

Mgr inż. Michał Glanowski

Doktorant

olga_zastawny.jpeg

Mgr Olga Zastawny

Doktorant

Agnieszka_Wojtkiewicz.jpg

Dr Agnieszka M. Wojtkiewicz

Post-doc

Patrycja_Wójcik.jpg

Mgr inż. Patrycja Wójcik

Doktorant

Beata_Mrugała_edited.jpg

Mgr Beata Mrugała

Doktorant

Hodowla bakterii, ekspresja i izolacja enzymu, przygotowanie mutantów i ich ekspresja

W pierwszej części projektu opracowujemy system ekspresji enzymu w E.coli, optymalizujemy warunki hodowli i protokół oczyszczania enzymu. Dokonujemy również mutacji punktowych kodonów wybranych aminokwasów w centrum aktywnym i izolujemy tak zmodyfikowane  wersje enzymu.  

Badanie mechanizmu reakcji metodami teoretycznymi i eksperymentalnymi

Trzecia część projektu dotyczy modelowania molekularnego możliwych ścieżek reakcji. Na początek będziemy stosować model homologiczny AcmB oparty o znaną strukturę KstD z Rodoccocus erythropolis a w późniejszym etapie dla modeli otrzymanych w wyniku rozwiązania struktury metodami XRD. W tego typu badaniach stosujemy symulacje MD, obliczenia QM, QM:MM oraz QM:MD do zweryfikowania hipotezy mechanistycznej i do przewidywania  kinetycznego efektu izotopowego.

Podziękowania

Projekt OPUS 11 pt. "Mechanizm regioselektywnego utleniającego odwodornienia 3-ketosteroidów przez dehydrogenazę Δ1-cholest-4-en-3-onu ze Sterolibacterium denitrificans" jest finansowany przez Narodowe Centrum Nauki.

Krystalizacja i rozwiązanie trójwymiarowej struktury AcmB. Badania nad czwartorzędową strukturą
enzymów

Jak dotąd struktura geometryczna enzymu i czwartorzędowa organizacja jest nieznana. Aby poznać strukturę czwartorzędową enzymu stosujemy kombinację różnych metod biofizycznych, takich jak sączenie molekularne, elektroforeza A-PAGE, dynamiczne rozpraszanie światła czy mikroskopię AFM. Ponadto prowadzimy przesiewowe badania zmierzające do odnalezienia optymalnych warunków krystalizacji enzymu i w przypadku powodzenia jego krystalizacji rozwiążemy jego strukturę z zastosowaniem metod dyfrakcji rentgenowskiej.

Weryfikacja mechanizmu reakcji za pomocą metod izotopowych i mutacji genowych

Równolegle do badań teoretycznych charakteryzujemy właściwości katalityczne AcmB metodami kinetycznymi. Pomiary kinetyczne w stanie stacjonarnym stosujemy do wyznaczania powinowactwa substratów i maksymalnej szybkości reakcji. Z kolei metody szybkiej kinetyki wstrzymanego przepływu są wykorzystywane do wyznaczenia stałych kinetycznych redukcji i reutleniania FAD. Eksperymenty prowadzone z deuterowanymi związkami dostarczą eksperymentalnych wartości kinetycznego efektu izotopowego, co pozwoli przetestować wyniki obliczeń teoretycznych.

Co robimy

 Naszym celem jest łączenie potencjału Instytutu Katalizy I Fizykochemii Powierzchni oraz Instytutu Fizjologii Roślin w dziedzinie biochemii i biotechnologii

Nasze projekty

Członkowie laboratories ubiegają się o krajowe i międzynarodowe projektu by realizować ambitne cele badawcze

Dołącz do nas

Jesteśmy otwarci na współpracę z naukowcami i przedsiębiorcami w ramach biegnących projektów jak również w zakresie zupełnie nowych kierunków badawczych

Kontakt

Jeśli masz pytania dotyczące naszych badań lub dostępu do aparatury nie wahaj się do nas napisać