W tym zadaniu mamy zamiar przebadać rolę  katalityczną szeregu reszt aminokwasowych znajdujących się w centrum aktywnym BSS wykorzystując metodę mutacji genetycznych. Mamy zamiar przebadać wpływ tych zmian na spektrum substratowe, stereospecyficzność enzymu. Celem również jest zgłębienie jak dotąd nieznanej roli centrów żelazo-siarkowych obecnych w enzymie.

Jak dotąd nie udało się przeprowadzić aktywacji in-vitro enzymów klasy FAE z ich nieaktywnej formy do aktywnej formy glicynowo-rodnikowej, Wykorzystując nasz system nadekspresji mamy zamiar opracować system aktywacji BSS i innych enzymów klasy FAE. Dzięki temu mamy nadzieje oczyścić i scharakteryzować enzymy aktywujące BSS oraz inne enzymy z klasy FAE.

W tym zadaniu planujemy poszerzyć dotychczasowo stosowaną klasterową metodologię modelowania mechanizmu reakcji na metodę multiskalową wykorzystującą podejście QM:MM. Modelowanie pozwoli przetestować naszą hipotezę, że zarówno termodynamiczne czynniki odpowiadające za wiązanie fumaranu w pozycji pro-R jak i czynniki kinetyczne w czasie reakcji katalitycznej odpowiadają za bezwzględną enancjoselektywność reakcji. Dodatkowo obliczenia pozwolą zracjonalizować efekty mutacji obserwowane eksperymentalnie oraz zaproponować miejsca mutacji, które będą wpływały na specyficzność substratową i enancjoselektywność enzymu. 

W tym zadaniu będziemy skupiali się na dalszych badaniach katalitycznego cyklu BSS i innych enzymów z rodziny FAE i weryfikacji przewidywań teoretycznych. Ten podprojekt będzie realizowany w ramach ścisłej współpracy Polsko-Niemieckiej i będzie skupiać się na kinetycznej charakterystyce substratów enzymów FAE. Zostaną opracowane metody analityczne wykorzystujące techniki HPLC i  LC-MS/MS do wyznaczenia kinetycznych efektów izotopowych oraz chiralności produktów. 

Projekt realizowany jest w ramach Polsko-Niemieckiej inicjatywy grantowej Beethoven Life 1 w ramach projektu pt. "Struktura i funkcja enzymów glicynowo-rodnikowych katalizujących addycję do fumaranu: biochemia, modelowanie i zastosowanie (FAEREACTION)". Projekt jest finansowany przez Narodowe Centrum Nauki (NCN Polska) oraz niemieckie Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

​

​

​

Wykorzystując system pozwalający na produkcję aktywnej rekombinowanej BSS mamy zamiar przebadać biochemię innych enzymów z klasy FAE. Jak dotąd było to niemożliwe ze względu na powolny wzrost produkujących je bakterii. W rezultacie poszerzymy naszą wiedzę na temat enzymów ortologicznych do BSS, które dotąd nie mogły być badane. Dla tych nowych enzymów planujemy równeiż podjąć starania zmierzające do ich wykrystalizowania co umożliwi poznanie ich struktury. 

Miejsca planowanych mutacji  w BSS  zostaną zaproponowane w oparciu o analizę sekwencji znanych enzymów homologicznych z tej klasy oraz dzięki racjonalnemu planowaniu, wspartemu symulacjami MD i teoretycznym modelowaniem molekularnym. Uzyskane wyniki dostarczą informacji o wpływie mutacji na termodynamikę wiązania substratu oraz na dynamikę zachowania substratu w centrum aktywnym enzymów klasy FAE.

W ramach tego zadania przeprowadzimy modelowanie dla innych enzymów z klasy FAE. Badania te będą oparte o dane strukturalne uzyskane z ich krystalizacji i analizy dyfrakcyjnej lub w oparciu o modelowanie homologiczne. W oparciu o te dane powstaną modele klasterowe i zostanie przeprowadzone modelowanie wykorzystujące metody QM. 

W ramach tego zadania opracujemy cało-komórkowy system do produkcji różnych adduktów bursztynianowych, które mogą okazać się interesującymi związkami do dalszej syntezy organicznej. Znany zakres produktów powstających dzięki katalitycznym zdolnościom enzymów z rodziny FAE dostarcza bardzo różnorodnego wachlarza chiralnych związków. Produkty te mogą znaleźć podobne zastosowanie do bursztynianu, jednej z najważniejszych platformowych cząsteczek w biotechnologii.