"Wolframowa Oksydoreduktaza Aldehydów - nowa hydrogenaza. Badania
mechanizmu reakcji i potencjalnych zastosowań biokatalitycznych" (2024-2028)
Opracowanie systemów ekspresji i produkcja
rekombinowanych enzymów
W pierwszej części projektu pozyskamy enzym AOR korzystajÄ…c z opracowanego systemu ekspresji w A. evansii. W tym zadaniu przeprowadzimy również optymalizacjÄ™ ekspresji w E. coli enzymów do kaskad (aldolaz, reduktaz aminowaych, transhydrogenazy, itd.). Systemy te zostaÅ‚y już opracowane przez miÄ™dzynarodowych partnerów projektu.
Skala produkcji enzymów zostanie zwiÄ™kszona i zoptymalizowana do warunków fermentorowych a enzymy zostanÄ… wyizolowane i oczyszczone metodÄ… chromatografii powinowactwa.
Badanie mechanizmu katalitycznego AOR
To zadanie bÄ™dzie skupiaÅ‚o siÄ™ na badaniach mechanizmu katalitycznego enzymu AOR. Do badan bÄ™dziemy wykorzystywać zarówno techniki eksperymentalne jak i metody modelowania molekularnego do przetestowania hipotezy mechanistycznej. Zastosujemy izotopowo znakowane substraty oraz technikÄ™ stopped flow i pomiary kinetyczne w stanie stacjonarnym aby wyznaczyć parametry kinetyczne reakcji poÅ‚ówkowych jak i obserwowane parametry kinetyczne dla zmutowanych wariantów enzymu. BÄ™dziemy również intensywnie badać spektrum substratowe, testujÄ…c granice specyficznoÅ›ci AOR i sprawdzajÄ…c czy enzym jest w stanie rozróżniać enancjomery kwasów karboksylowych w czasie ich redukcji. Eksperymenty te bÄ™dÄ… intensywnie wykorzystywaÅ‚y technikÄ™ UHPLC-MS z powodu braku testów kinetycznych wykorzystujÄ…cych UV-vis. Z kolei do badan enancjospecyficznoÅ›ci reakcji zastosujemy chromatografiÄ™ chiralnÄ….
​
W zadaniu tym bÄ™dziemy również wykorzystywać symulacje MD i obliczenia kwantowo-chemiczne metodami QM i QM:MM do przetestowania różnych wariantów mechanizmu reakcji utleniania aldehydów i wodoru oraz redukcji kwasów karboksylowych.
Podziękowania
Projekt OPUS 26 "Wolframowa Oksydoreduktaza Aldehydów - nowa hydrogenaza. Badania mechanizmu reakcji i potencjalnych zastosowaÅ„ biokatalitycznych" jest finansowany ze Å›rodków Narodowego Centrum Nauki (NCN).
Charakterystyka strukturalna
i spektroskopowa AOR
W tym zadaniu zastosujemy nowatorskie techniki spektroskopowe i analizy strukturalnej takie jak wysokorozdzielcza kromikroskopia elektronowa, EXAFS i EPR.
W badaniach bÄ™dziemy wykorzystywać genetycznie zmodyfikowanÄ… wersjÄ™ enzymu AOR, która nie tworzy oligomerów - tak aby uproÅ›cić badanÄ… strukturÄ™ w analizach cryo-EM. Postaramy siÄ™ uzyskać struktury enzymu na różnych etapach reakcji.
Z kolei technika EXAFS wsparta modelowaniem QM:MM pozwoli nam scharakteryzować kofaktor wolframowy w centrum aktywnym. Na koniec technika EPR zastosowana do AOR w stanie jakim izoluje się go z bakterii jak i po redukcji z zastosowaniem metody szybkiego wymrażania pozwoli na zbadanie zmian stopnia utleniania atomu wolframu.
Opracowanie kaskad enzymatycznych wykorzystujÄ…cych
AOR i H2
W ramach tego zadania opracujemy kilka systemów kaskadowych, które wykorzystujÄ… AOR w pierwszym kroku (do redukcji kwasów karboksylowych do aldehydów). Zaczniemy od już przetestowanego systemu z dehydrogenazÄ… alkoholowÄ… BaDH i skoncentrujemy siÄ™ na poszerzeniu zakresu konwertowanych substratów (przede wszystkim wprowadzajÄ…c modyfikacje w pierÅ›cieniu fenylowym). Przetestujemy również system komórkowy zawierajÄ…cy AOR i BaDH, który jest opracowywany przez naszych partnerów w Marburgu.
W ramach badaÅ„ zamierzamy przebadać szerokÄ… gamÄ™ enzymów, które katalizujÄ… konwersjÄ™ aldehydów, takich jak aldolazy, reduktazy iminowe i aminowe oraz aminotrasnferazy.