W pierwszej części projektu pozyskamy enzym  AOR korzystając z opracowanego systemu ekspresji w A. evansii.  W tym zadaniu przeprowadzimy również optymalizację ekspresji w E. coli enzymów do kaskad (aldolaz, reduktaz aminowaych, transhydrogenazy, itd.). Systemy te zostały już opracowane przez międzynarodowych partnerów projektu. 

Skala produkcji enzymów zostanie zwiększona i zoptymalizowana do warunków fermentorowych a enzymy zostaną wyizolowane i oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa. 

To zadanie będzie skupiało się na badaniach mechanizmu katalitycznego enzymu AOR. Do badan będziemy wykorzystywać zarówno techniki eksperymentalne jak i metody modelowania molekularnego do przetestowania hipotezy mechanistycznej. Zastosujemy izotopowo znakowane substraty oraz technikę stopped flow i pomiary kinetyczne w stanie stacjonarnym aby wyznaczyć parametry kinetyczne reakcji połówkowych jak i obserwowane parametry kinetyczne dla zmutowanych wariantów enzymu. Będziemy również intensywnie badać spektrum substratowe, testując granice specyficzności AOR i sprawdzając czy enzym jest w stanie rozróżniać enancjomery kwasów karboksylowych w czasie ich redukcji. Eksperymenty te będą intensywnie wykorzystywały technikę UHPLC-MS z powodu braku testów kinetycznych wykorzystujących UV-vis. Z kolei do badan enancjospecyficzności reakcji zastosujemy chromatografię chiralną.

​

W zadaniu tym będziemy również wykorzystywać symulacje MD i obliczenia kwantowo-chemiczne metodami QM i QM:MM do przetestowania różnych wariantów mechanizmu reakcji utleniania aldehydów i wodoru oraz redukcji kwasów karboksylowych.

Projekt OPUS 26 "Wolframowa Oksydoreduktaza Aldehydów - nowa hydrogenaza. Badania mechanizmu reakcji i potencjalnych zastosowań biokatalitycznych" (2023/51/B/ST4/01224) jest finansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki (NCN). 

W tym zadaniu zastosujemy nowatorskie techniki spektroskopowe i analizy strukturalnej takie jak wysokorozdzielcza kromikroskopia    elektronowa, EXAFS i EPR.

W badaniach będziemy wykorzystywać genetycznie zmodyfikowaną wersję enzymu AOR, która nie tworzy oligomerów  - tak aby uprościć badaną strukturę w analizach cryo-EM. Postaramy się uzyskać struktury enzymu na różnych etapach reakcji.

Z kolei technika EXAFS wsparta modelowaniem QM:MM pozwoli nam scharakteryzować kofaktor wolframowy w centrum aktywnym. Na koniec technika EPR zastosowana do AOR w stanie jakim izoluje się go z bakterii jak i po redukcji z zastosowaniem metody szybkiego wymrażania pozwoli na zbadanie zmian stopnia utleniania atomu wolframu. 

W ramach tego zadania opracujemy kilka systemów kaskadowych, które wykorzystują AOR w pierwszym kroku (do redukcji kwasów karboksylowych do aldehydów). Zaczniemy od już przetestowanego systemu z dehydrogenazą alkoholową BaDH i skoncentrujemy się na poszerzeniu zakresu konwertowanych substratów (przede wszystkim wprowadzając modyfikacje w pierścieniu fenylowym). Przetestujemy również system komórkowy zawierający AOR i BaDH, który jest opracowywany przez naszych partnerów w Marburgu.

W ramach badań zamierzamy przebadać szeroką gamę enzymów, które katalizują konwersję aldehydów, takich jak aldolazy, reduktazy iminowe i aminowe oraz aminotrasnferazy.